染色质免疫沉淀(ChIP)技术的难点

过柱机biotage 26-01-26 11:20:11

染色质免疫沉淀技术(Chromatin Immunoprecipitation,简称ChIP)是研究体内蛋白质与DNA相互作用的一种技术。它利用抗原抗体的特异性反应,可以真实地反映体内蛋白分子与基因组DNA结合的状况。下面我们就基本的实验步骤,实验中的小技巧以及需要注意的问题简单介绍一下。

1. 细胞固定

甲醛能有效的使蛋白质-蛋白质,蛋白质-DNA,蛋白质-RNA交联,形成生物复合体,防止细胞内组分的重新分布。交联所用的甲醛终浓度为1%,交联时间通常为5分钟到1个小时。需注意的是,交联时间如果过长,细胞染色质难以用超声波破碎,影响ChIP结果,而且实验材料也容易在离心过程中丢失。交联时间如果过短,则交联不完全,产生假阴性。甲醛的交联反应可被加入的甘氨酸终止。

2. 染色质片段化

交联后的染色质需被超声波切成400~600 bp的片段,以便目的蛋白的暴露,利于抗体识别,其片段破碎的均匀一致性对结果影响至关重要。传统的超声波破碎是利用机械力断裂染色质,容易引起升温或产生泡沫,这都会引起蛋白质变性,进而影响ChIP的效率。而来自比利时的Bioruptor非接触式超声波破碎仪采用温和的破碎方式,保证了蛋白的活性,DNA破碎效果均一,同时外接水循环仪保证了实验的温度稳定性,成为目前ChIP实验的广泛应用。

3. 染色质免疫沉淀反应

Input对照:

在进行免疫沉淀前,需要取一部分断裂后的染色质做Input对照。Input需要与沉淀后的样品DNA一起经过逆转交联,DNA纯化,以及检测。Input对照不仅可以验证染色质断裂的效果,还可以根据Input中的靶序列的含量以及染色质沉淀中的靶序列的含量,按照取样比例换算出ChIP的效率,所以Input对照是ChIP实验必不可少的步骤。

Beads选择:

接下来,利用目的蛋白质的特异抗体通过抗原-抗体特异反应形成DNA-蛋白质-抗体复合物,然后使用Agarose beads或Magnabeads沉淀此复合物,特异性地富集与目的蛋白结合的DNA片段。再经过多次洗涤,除去非特异结合的染色质后,用SDS+NaHCO3洗脱免疫沉淀复合物。

抗体选择:

染色质免疫沉淀所选择的目的蛋白的抗体是ChIP实验成功的关键。因为在蛋白质与染色质交联结合时,抗体的抗原表位可能因为与结合位点的距离太近,不能被抗体识别,所以不能有效地在体内形成免疫沉淀复合物,直接影响ChIP的结果。

阴性对照设置:

在做ChIP实验时,需设置对照,以便于对实验结果的可靠性进行评估。阳性抗体和阴性抗体对照是基本的实验对照。阳性抗体通常选择与已知序列相结合的比较保守的蛋白的抗体,常用的包括组蛋白抗体或RNAPolymerase II抗体等。阴性抗体通常选择目的蛋白抗体宿主的IgG或血清。目的蛋白抗体的结果与阳性抗体和阴性抗体的结果相比较,才能得出正确结论。另外,还应考虑目的蛋白抗体与DNA的非特异性结合的可能,所以通常还会选择一对阴性引物,即目的蛋白肯定不会结合的DNA序列,作为该抗体的阴性对照。阴性对照引物是在靶序列上游的一段与目的蛋白肯定不能结合的序列。如果目的蛋白没有商品化的适用于染色质免疫沉淀实验的抗体,只有其他用途的抗体时,可以先做蛋白质免疫沉淀检测。如果抗体可以成功的沉淀蛋白,再进行染色质免疫沉淀实验的检测。

4. 交联反应的逆转和DNA的纯化

用不含DNase的RNase和Proteinase K,65℃保温6小时逆转交联,经DNA纯化柱回收DNA或用酚氯仿抽提、乙醇沉淀纯化DNA。在逆转交联时不使用Proteinase K,然后用丙酮回收有机相中的蛋白质,进行分析。

5. DNA的鉴定

常用的DNA的鉴定方法是半定量PCR和Real-time PCR。由于启动子区域序列多样性的特点,所以不同的细胞系或不同的动物品系的同一基因的启动子序列有可能不同,因此可设计多对引物来反复验证ChIP实验的结果.

仪器推荐
  1. FluxData SpectraNova FD-D8-M2分光测色仪

    FluxData SpectraNova FD-D8-M2分光测色仪

    FluxData FD-D8-M2分光测色仪是我们以稳定、快速为目标而重新定义和设 计的一款产品。测量头以极易清洁的蓝宝石窗口片密封,用于在工 业生产环境中保护内部的积分球不受污染。测量数据可以通过“机对机”式交互即时传……

    FluxData,测色仪 2025-12-29

  2. SinapTec Lab120 Axial实验室超声波破碎仪

    SinapTec Lab120 Axial实验室超声波破碎仪

    法国SinapTec起源于研究实验室,现已发展成为一家独立的中小企业,在超声技术的开发和实施方面拥有超过35年的经验。35年的创新成果将超声波广泛应用于制造业,医疗保健和环境敏感领域(温度,压力,爆炸性环境或辐……

    SinapTec 2026-01-20

  3. Histotripsy 组织摧毁术/空化机械消融应用方案

    Histotripsy 组织摧毁术/空化机械消融应用方案

    Histotripsy 压力脉冲超声组织粉碎术,又称组织摧毁术(PSHT)是一种新兴的非热、非电离、非侵入性以及超高精度的特点使得周围健康组织则因超声焦点的精确控制而保持完整,上述特点使得该技术显示出不可比拟的干预(……

    仪器应用,仪器方案 2026-01-29

  4. 美国进口PRO均质器:专注样品混匀乳化

    美国进口PRO均质器:专注样品混匀乳化

    美国PRO公司于1992年在牛津康涅狄格注册成立,主要生产均质器,从亚细胞分析,到大批量应用。 //均质原理(转子/定子原理)//   转子高速旋转,物料沿轴向被吸入分散头然后呈放射状被甩出定转子齿槽。 高转速转……

    PRO 2026-01-19

  5. VELP UDK159全自动凯氏定氮仪

    VELP UDK159全自动凯氏定氮仪

    VELP UDK 159全自动凯氏定氮仪,可用于不同应用的分析,如测定氨氮、蛋白质测定、氮含量(凯氏定氮或直接碱性蒸馏)、硝氮(还原后/Devarda)、酚类、挥发性酸、氰化物和酒精含量。 全自动分析 全自动凯氏蒸馏和滴定系……

    VELP,进口凯氏定氮仪 2026-01-30

  6. BUCHI R-220 Pro工业旋转蒸发仪

    BUCHI R-220 Pro工业旋转蒸发仪

    BUCHI R-220 Pro工业旋转蒸发仪 如果要提高实验室流程规模,工业旋转蒸发仪 R-220 Pro 系列可为您提供:广泛类型的玻璃组件,高性能系统,不间断的运行,一个经济实惠的型号满足基本需求。 蒸馏速率:高达 12 L 乙……

    BUCHI,进口旋蒸 2026-01-01

今日仪器
  1. VELP UDK159全自动凯氏定氮仪

    VELP UDK159全自动凯氏定氮仪

    VELP UDK 159全自动凯氏定氮仪,可用于不同应用的分析,如测定氨氮、蛋白质测定、氮含量(凯氏定氮或直接碱性蒸馏)、硝氮(还原后/Devarda)、酚类、挥发性酸、氰化物和酒精含量。 全自动分析 全自动凯氏蒸馏和滴定系……

    VELP,进口凯氏定氮仪 2026-01-30

  2. VACUUBRAND ME 4C NT 化学隔膜泵

    VACUUBRAND ME 4C NT 化学隔膜泵

    VACUUBRAND化学隔膜泵 ME 4C NT专为化学设计的隔膜泵是针对腐蚀性气体和蒸汽的一种持续的、无油抽气的解决方案。单级泵的结构同时具有抽气速度大和达70mbar的真空的优点。所有与被抽介质接触的主要部件均由化学防……

    VACUUBRAND 2026-01-30

  3. Sonic Concepts高频超声换能器:HIFU Plex LT™ 3D深度聚焦系统

    Sonic Concepts高频超声换能器:HIFU Plex LT™ 3D深度聚焦系统

    Sonic Concepts高频超声换能器 超声波应用-医疗,生物技术等 HIFU transducers高频超声换能器/高频超声换能探头/环形高功率超声探头/宽频超声空化 美国Sonic Concepts公司成立于1994年,HIFU(高频超声换能)技术致力……

    Sonic Concepts,聚焦超声 2026-01-30

返回顶部小火箭